Ketika ia sedang mempertimbangkan masalah ini, Banting membaca dalam sebuah jurnal medis. Artikel tersebut ditulis oleh Moses Baron, yang menunjukkan bahwa ketika saluran pankreas secara eksperimental ditutup dengan pengikat, sel-sel pankreas yang mensekresi trypsin mengalami degenerasi, namun pulau-pulau Langerhans tetap utuh.
Hal ini memberi kesan kepada Banting bahwa ligasi saluran pankreas, dengan menghancurkan sel-sel yang mensekresi trypsin akan menghindari penghancuran insulin. Sehingga, setelah waktu yang cukup untuk terjadinya degenerasi sel-sel yang mensekresi trypsin, insulin mungkin akan hilang diekstraksi dari pulau Langerhans yang utuh.
Bertekad menyelidiki kemungkinan tersebut, Banting mendiskusikannya dengan Dr. John J.R. Macleod, Profesor Fisiologi di Universitas Toronto. Macleod memberinya fasilitas untuk penelitian eksperimental mengenai hal itu.
Charles Best, yang saat itu adalah seorang mahasiswa kedokteran, ditunjuk sebagai asisten Banting. Banting dan Best bersama-sama memulai pekerjaan yang mengarah pada penemuan insulin.
Banting dan Best memulai eksperimen mereka dengan melakukan prosedur pengangkatan pankreas dan ligasi saluran pada anjing.
Banyak upaya yang gagal karena anjing tidak dapat bertahan hidup. Dua anjing yang pankreasnya diangkat telah sembuh dan tujuh anjing yang telah menjalani prosedur ligasi saluran dalam kondisi baik.
Banting dan Best melanjutkan menyiapkan ekstrak pankreas pertama mereka, menggunakan instruksi rinci yang ditinggalkan oleh Macleod.
Anjing dengan kode 410 adalah yang pertama menerima suntikan ekstrak pankreas. Ekstraknya memiliki efek yang jelas tetapi anjing tersebut mengalami koma diabetes dan meninggal keesokan harinya.
Anjing dengan kode 408 menerima suntikan ekstrak pankreas, glukosa darahnya berhasil turun. Banting dan Best menyebut ekstraknya sebagai “Isletin”.
Banting dan Best mempresentasikan penelitian mereka di Journal Club Departemen Fisiologi Universitas Toronto. Macleod mengundang Dr. James Collip untuk bergabung dengan tim peneliti untuk melanjutkan pengembangan dan pemurnian ekstrak pankreas.
Collip menggunakan alat vakum untuk menguapkan alkohol dari larutan ekstrak. Ekstrak ini bekerja sangat baik dalam mengurangi kadar glukosa darah pada anjing yang diberikan.
Banting menyampaikan makalah tentang penelitiannya yang berjudul “Pengaruh Menguntungkan Ekstrak Pankreas Tertentu pada Diabetes Pankreas” pada Pertemuan Tahunan American Physiological Society ke-34 di New Haven, AS.