Pekerjaan penting ini dimulai pada tahun 1938 ketika Florey, yang telah lama tertarik pada cara bakteri dan jamur saling membunuh secara alami, menemukan makalah Fleming tentang jamur penicillium sambil membuka-buka beberapa edisi The British Journal of Experimental Pathology.
Segera saja setelah itu, Florey dan rekan-rekannya berkumpul di laboratoriumnya yang lengkap. Mereka memutuskan untuk mengungkap ilmu pengetahuan di balik apa yang disebut Fleming sebagai “aksi antibakteri” penicillium.
Salah satu karyawan Florey yang paling cerdas adalah seorang ahli biokimia, Dr. Ernst Chain.
Chain adalah orang yang spontan, kasar, dan sangat sensitif yang terus-menerus bertengkar dengan Florey mengenai siapa yang pantas mendapatkan pujian karena mengembangkan penisilin. Terlepas dari perjuangan mereka, mereka menghasilkan serangkaian ekstrak cairan kultur jamur penicillium mentah.
Selama musim panas tahun 1940, percobaan mereka berpusat pada sekelompok 50 tikus yang telah mereka infeksi dengan streptokokus yang mematikan. Separuh dari tikus tersebut meninggal secara mengenaskan akibat sepsis yang parah. Korban lainnya, yang menerima suntikan penisilin, selamat.
Pada saat itulah Florey menyadari bahwa dia mempunyai cukup informasi yang menjanjikan untuk menguji obat tersebut pada manusia. Namun masalah tetap ada: bagaimana memproduksi penisilin murni dalam jumlah yang cukup untuk mengobati manusia.
Meskipun ada upaya untuk meningkatkan hasil kultur jamur, tetapi dibutuhkan 2.000 liter cairan kultur jamur untuk memperoleh penisilin murni yang cukup untuk mengobati satu kasus sepsis pada seseorang.
Pada bulan September 1940, seorang polisi Oxford, Albert Alexander, 48, memberikan kasus uji coba pertama. Alexander mencungkil wajahnya saat bekerja di taman mawarnya. Goresan yang terinfeksi streptokokus dan stafilokokus menyebar ke mata dan kulit kepala.
Meskipun Alexander dirawat di Rumah Sakit Radcliffe dan diobati dengan obat sulfa, infeksinya memburuk dan mengakibatkan abses membara di mata, paru-paru, dan bahu. Florey dan Chain mendengar tentang kasus mengerikan itu di meja tinggi pada suatu malam dan, segera, bertanya kepada dokter Radcliffe apakah mereka dapat mencoba penisilin yang telah “dimurnikan”.
Setelah lima hari disuntik, Alexander mulai pulih. Namun Chain dan Florey tidak memiliki cukup penisilin murni untuk memberantas infeksi tersebut, dan Alexander akhirnya meninggal.
Sadar bahwa jamur Penicillium notatum tidak akan pernah menghasilkan cukup penisilin untuk mengobati manusia, Florey dan seorang ahli biokimia, Dr. Norman Heatley mencari spesies yang lebih produktif.