Dengan pernikahannya, Mary menentang semua elemen yang berkepentingan dengan struktur kekuasaan Skotlandia. Elizabeth, yang tidak menyetujui Mary menikahi keturunan Tudor lainnya. Dan saudara tirinya James, yang iri dengan naiknya keluarga Lennox ke tampuk kekuasaan, segera memberontak.
Karakter Darnley juga tidak sesuai dengan penampilannya—dia lemah, kejam, tetapi ambisius. Suaminya melakukan eksekusi kejam terhadap sekretaris dan orang kepercayaannya, David Riccio (Rizzio), di depan matanya sendiri. Hal ini meyakinkan Mary bahwa suaminya telah mengincar nyawanya sendiri.
Kelahiran putra mereka, James, pada bulan Juni tidak memberikan dampak apa pun untuk mendamaikan pasangan tersebut. Mary, yang kini sudah memiliki ahli waris yang ia dambakan, mencari cara untuk meringankan situasi yang tidak dapat ditoleransi.
Delapan bulan berikutnya merupakan periode paling rumit dan kontroversial dalam kehidupan Mary. Menurut para pengkritik Mary, pada periode inilah dia memiliki hubungan asmara dengan James Hepburn, earl ke-4 dari Bothwell.
Keduanya merencanakan bersama kematian Darnley dan pernikahan mereka berikutnya. Namun, tidak ada bukti kontemporer mengenai hubungan cinta ini.
Mary tentu saja mempertimbangkan untuk bercerai dengan Darnley, setelah Darnley menderita penyakit serius pada bulan Oktober 1566. Penyakit tersebut menyebabkan kesehatan Darnley memburuk dan semangatnya rendah.
Pada malam tanggal 9 Februari 1567, kediaman Darnley diledakkan. Darnley sendiri dicekik ketika mencoba melarikan diri.
Banyak teori telah dikemukakan untuk menjelaskan laporan kejahatan yang saling bertentangan. Termasuk kemungkinan bahwa Darnley, yang berencana mencelakakan Mary, terjebak dalam perangkapnya sendiri. Namun para bangsawan yang membenci Darnley kemungkinan adalah pelakunya.
Setelah tiga bulan, dia membiarkan dirinya dinikahkan dengan Bothwell, tersangka utama, setelah dia menculik dan memerkosanya. Perilaku Mary dapat dianggap berasal dari keputusasaannya yang semakin meningkat.
Diperburuk oleh kesehatan yang buruk, Mary tidak mampu menangani urusan-urusan Skotlandia yang penuh gejolak tanpa lengan yang kuat untuk mendukungnya. Namun kenyataannya, peran baru Bothwell tidak dapat diterima oleh bangsawan Skotlandia.
Mary dan Bothwell berpisah selamanya di Carberry Hill pada tanggal 15 Juni 1567. Bothwell diasingkan dan dipenjarakan di mana dia meninggal pada tahun 1578.
Adapun Mary dipenjara di pulau kecil Loch Leven. Ia secara resmi digulingkan demi anak laki-lakinya.