Mengolah, mengekstraksi, memurnikan, dan menyimpan penisilin menjadi tujuan tim peneliti.
Edward Abraham (1913-1999) menemukan struktur penisilin yang benar, sementara Norman Heatley (1911-2004) merekomendasikan memasukkan kembali antibakteri ke dalam air sehingga mengubah keasamannya.
Kedua penemuan tersebut memungkinkan produksi penisilin dalam jumlah yang cukup untuk memulai uji coba pada hewan mengenai kemanjuran penisilin.
Tes awal dirancang untuk menentukan toksisitas penisilin. Tikus, mencit, kelinci, dan kucing disuntik penisilin setelah terpapar berbagai bakteri berbahaya. Tes ini membuktikan keefektifan penisilin.
Untungnya, para peneliti tidak menggunakan marmut sebagai hewan percobaan karena penisilin beracun bagi hewan tersebut.
Marmut memiliki mikrobioma usus, atau flora usus yang hidup di saluran pencernaannya. Bila dikombinasikan dengan penisilin, menyebabkan hewan tersebut mengalami diare dan kematian.
Pada bulan Mei 1940, Howard Florey (1898-1968) dan Ernest Chain (1906-1979) menginfeksi sekelompok tikus dengan streptokokus.
Separuh dari tikus, yang tidak diobati, mati karena sepsis; setengahnya yang diobati dengan penisilin selamat.
Percobaan lebih lanjut dengan menggunakan hewan dalam jumlah yang terus meningkat menghasilkan hasil yang serupa.
Eksperimen pada manusia dimulai sejak tahun 1929 ketika Fleming berusaha menyembuhkan infeksi hidung tetapi gagal karena bakteri penyebab infeksi tersebut tidak rentan terhadap penisilin.
Salah satu murid Fleming, Cecil George Paine (1905-1994), berhasil menggunakan penisilin untuk mengobati dan menyembuhkan konjungtivitis pada orang dewasa dan anak-anak pada bulan November 1930.
Banyak cerita tentang upaya awal penggunaan penisilin untuk mengobati infeksi pada manusia.